A caracterização bioquímica da polifenol oxidase de Dimocarpus longan fornece informações sobre sua eficiência catalítica

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 20322 (2022) Citar este artigo

945 Acessos

1 Citações

3 Altmétrica

Detalhes das métricas

As frutas "olho de dragão" produzidas pela longan tropical são ricas em nutrientes e antioxidantes. Eles sofrem de escurecimento enzimático pós-colheita, um processo pelo qual a família de enzimas polifenol oxidase (PPO) é responsável principalmente. Neste estudo, dois cDNAs que codificam o PPO foram clonados de folhas de Dimocarpus longan (Dl), expressos de forma heteróloga em Escherichia coli e purificados por cromatografia de afinidade. O prepro-DlPPO1 contém dois peptídeos de sinal em sua extremidade N-terminal que facilitam o transporte da proteína para o estroma do cloroplasto e para o lúmen do tilacoide. A remoção dos dois peptídeos de sinal de prepro-DlPPO1 produz pro-DlPPO1. O prepro-DlPPO1 exibiu maior tolerância térmica do que o pro-DlPPO1 (desdobramento a 65 °C vs. 40 °C), sugerindo que o peptídeo sinal pode estabilizar a dobra do DlPPO1. DlPPO1 pode ser classificado como uma tirosinase porque aceita substratos monofenólicos e difenólicos. O pro-DlPPO1 exibiu a maior especificidade para o difenol (–)-epicatequina natural (kcat/KM de 800 ± 120 s−1 mM−1), que é maior do que para o 4-metilcatecol (590 ± 99 s−1 mM− 1), pirogalol (70 ± 9,7 s−1 mM−1) e ácido cafeico (4,3 ± 0,72 s−1 mM−1). As eficiências cinéticas de prepro-DlPPO1 são 23, 36, 1,7 e 4,7 vezes menores, respectivamente, do que aquelas observadas com pro-DlPPO1 para os quatro substratos difenólicos mencionados acima. Além disso, estudos de docking mostraram que a (–)-epicatequina tem uma energia de ligação mais baixa do que qualquer outro substrato investigado. Ambos os estudos cinéticos e in-silico sugerem fortemente que (-)-epicatequina é um bom substrato de DlPPO1 e verificam a afinidade de PPOs para compostos flavonóides específicos.

Polifenol oxidases (PPOs) são metaloenzimas dicopper tipo III presentes em bactérias1, fungos2,3, archaea4, plantas5, insetos6,7 e animais, incluindo humanos8,9. A família PPO contém tirosinases (TYRs)10,11,12,13 e catecol oxidases (COs)14,15. Os TYRs catalisam a orto-hidroxilação de monofenóis a o-difenóis (atividade de monofenolase, EC 1.14.18.1) e subsequentemente a oxidação dos o-difenóis correspondentes a o-quinonas (atividade de difenolase, EC 1.10.3.1), enquanto os COs só podem realizar a última atividade difenolase13,16. As quinonas resultantes são compostos altamente reativos e polimerizam rapidamente de forma não enzimática, formando pigmentos complexos amarelos a pretos conhecidos como melaninas17,18.

In vivo, as PPOs vegetais são traduzidas como uma proteína precursora (prepro-PPO), correspondendo à tradução de ~ 600 aminoácidos com aproximadamente 60–75 kDa19,20. Um prepro-PPO contém três domínios distintos; uma sequência de sinal N-terminal, o domínio cataliticamente ativo que abriga o sítio Cu-Cu e um domínio C-terminal que protege o domínio ativo5,20,21 (Figura S1). A sequência de sinal (~ 80–100 aminoácidos) direciona a proteína para seu destino subcelular enquanto ela própria está sendo clivada22,23. Após a translocação através da membrana tilacóide, a proteína passageira restante é processada em uma forma latente (pró-forma), que geralmente é relatada como sendo de 45 a 69 kDa14. O centro de cobre binuclear, onde cada cobre é coordenado individualmente por três resíduos de histidina17,24 localizados no domínio ativo, permanece blindado pelo domínio C-terminal, impedindo efetivamente a exposição do sítio ativo a substratos candidatos. A latência aumenta quando o domínio C-terminal é separado do sítio ativo. In vitro, a interrupção pode ser afetada por proteases (por exemplo, tripsina, proteinase K)25, pH ácido ou básico24, ácidos graxos26 e detergentes artificiais (por exemplo, dodecil sulfato de sódio, SDS)17,27,28,29,30,31, 32,33. Embora o mecanismo proteolítico natural seja desconhecido17, recentemente foi relatado que as PPOs vegetais são capazes de autoativação, o que pode separar autoproteoliticamente a enzima ativa do domínio C-terminal34,35,36.